Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06 Ludwig-Maximilians-Universität München

Bacteria necessitate multiple signal transduction systems to sense the ever-changing environments and mediate the cellular response accordingly. The major bacterial signal transduction systems are one-component system (1CS), two-component system (2CS) and extracytoplasmic function (ECF) σ factor. Compared to 1CSs and 2CSs, ECF σ factors have only been identified much later and therefore the knowledge about their molecular mechanisms and physiological roles is less profound. This thesis mainly focuses on the study of ECF σ factors from the bacterial phyla, Planctomycetes and Actinobacteria.

Polarity is a fundamental feature of almost all cells. It generally refers to the asymmetric organization of several cellular components. The plasma membrane, for example, exhibits both a transbilayer and a lateral asymmetry in most eukaryotic cells. Lipids are asymmetrically distributed between the cytoplasmic and the extracellular leaflet of the membrane and segregate laterally together with specific proteins to form dynamic nanoscale assemblies, known as rafts. Polarity can also specifically describe the asymmetric distribution of key molecules within a cell. These molecules, known as polarity determinants, can orient a multitude of specialized cellular functions, such as cell shape, cell division and fate determination.
In the framework of this thesis, we aimed to reconstitute essential features of membrane unmixing and cell polarity with a "bottom-up" synthetic biology approach. We worked with both: pure lipid systems, whose unmixing is driven by the asymmetric distribution of lipids in the two leaflets, and a lipid-protein system, whose polarization is instead due to reaction-diffusion mechanisms. In both cases, we used Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) and Sup- ported Lipid Bilayers (SLBs) to model biological membranes and employed modern biophys- ical techniques, such as fluorescence correlation spectroscopy, to quantitatively characterize lipid bilayers and protein-lipid interactions.
In the pure lipid systems, we first reconstituted membrane transbilayer asymmetry, applying a cyclodextrin-mediated lipid exchange method, which enables us to enrich membranes with lipids of choice. The enrichment of the membrane with sphingomyelin and/or cholesterol triggers the segregation of lipids into two coexisting asymmetric phases both in SLBs and GUVs, whereas exchanging different amounts of phosphatidylglycerol with the outer leaflet of the GUV membranes controls vesicle shape. Tuning the lipid content of model membranes revealed that small changes in the composition of one leaflet affect the overall lipid miscibility of the bilayer and that membrane shape transformations are possible also in absence of a protein machinery and as a consequence of the lipid redistribution in the membrane.
In the protein-lipid system, we aimed to reconstitute a minimal polarization system inspired by the C. elegans embryo at one-cell stage, which polarize along the anterior-posterior axis by sorting the PARtitioning defective (PAR) proteins into two distinct cortical domains. In this system polarity is maintained by the mutual inhibition between anterior (aPARs: PAR-3, PAR-6 and PKC-3) and posterior (pPARs: PAR-1, PAR-2 and LGL-1) PARs, which reciprocally antagonize their binding to the cortex, mutually excluding each other. We focused on LGL-1, which acts directly on PAR-6. Submitting LGL-1 to model membranes allowed us to identify a conserved region of the protein that binds negatively-charged membranes and to determine its lipid binding affinity and specificity. Selected LGL-1 mutants were then gen- erated to better understand the electrostatic mechanism involved in the membrane binding. LGL-1 was finally combined with PKC-3 to generate a functional membrane binding switch.

Adulte Weichgewebesarkome (engl. soft tissue sarcoma; STS) werden zu einer Gruppe seltener maligner und teilweise aggressiver Tumoren klassifiziert, die eine Tendenz zur Bildung von hämatogenen Fernmetastasen aufweisen. Die Kombination der Regionalen Hyperthermie mit einer Chemotherapie erwies sich in vorangegangenen Studien als eine vielversprechende Behandlungsoption beim lokalisierten Hochrisiko STS. Es wurde gezeigt, dass eine neoadjuvante Chemotherapie mit Regionaler Hyperthermie bei diesen Sarkomen das Tumoransprechen, das lokale progressionsfreie und das krankheitsfreie Überleben im Vergleich zu einer alleinigen Chemotherapie signifikant verbessert. Auf zellulärer Ebene induziert ein Hitzeschock (HS) bei klinisch relevanten Temperaturen (41,8°C/43°C) unter anderem eine temporäre Defizienz der Homologen Rekombinationsreparatur (HR), einem essentiellen Mechanismus für die fehlerfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB). Dies steht im Zusammenhang mit einer hitzeinduzierten proteosomalen Degradierung von BRCA2, einer unerlässlichen Komponente der HR.
Trabectedin (Tr) ist eine antiproliferativ wirksame Substanz, die ursprünglich aus dem marinen Tunikat Ecteinascidia turbinata isoliert wurde. Die vielfältigen zytotoxischen Aktivitäten von Tr umfassen neben dem Interferieren mit der aktivierten Transkription und der Modulation der Tumor-Mikroumgebung hauptsächlich die Induktion von DSBs. Seit 2007 wird Tr in der Zweitlinientherapie zur Behandlung refraktärer STS, sowie bei Patienten eingesetzt, bei denen die Erstlinientherapie (Ifosfamid und/oder Doxorubicin) nicht angewendet werden kann.
In Anbetracht der hitzeinduzierten Inaktivierung von BRCA2 und den DNA schädigenden Eigenschaften von Tr wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie die Hyperthermie zu einer Wirkungsverstärkung der zytotoxischen Effekte von Tr beitragen kann.
Tr bewirkt in vitro bei Zelllinien unterschiedlicher Sarkomentitäten (U2Os, SW872, SW982) eine dosisabhängige Reduktion des klonogenen Überlebens, das durch einen HS zusätzlich verstärkt wird. Die erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem HS wird als thermale Chemosenitivierung definiert. Zudem konnte durch die Analyse der DNA-Verteilung bei U2Os und SW872 Zellen eine Intensivierung und Verlängerung der Tr-induzierten G2/M-Blockade nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden Zelllinien-spezifische Unterschiede bezüglich einer behandlungsinduzierten Apoptoseinduktion oder Senseszenzantwort identifiziert. SW872 Zellen weisen einen dosis- und temperaturabhängigen Anstieg des Anteiles apoptotischer Zellen auf, der mit einer starken Aktivierung der Effektorcaspasen 3 und 7 einhergeht. Dem entgegen gehen U2Os Zellen in eine ausgeprägte behandlungsinduzierte zelluläre Seneszenz über. Anhand der quantitativen Analyse Tr-induzierter H2AX Foci hat sich ein relevanter Anstieg an DSBs durch eine zusätzliche Hitzeexposition herausgestellt, der eine Beeinträchtigung der BRCA2-vermittelten vollständigen Assemblierung der DNA-Reparaturfoci vermuten lässt.
Die Hypothese einer thermalen Chemosensitivierung gegenüber Tr durch eine hitzeinduzierte HR-Defizienz – insbesondere im Rahmen der hitzeinduzierten BRCA2 Degradierung – wurde zudem durch das Ausbleiben der hitzebedingten Verstärkung der Tr-induzierten Zytotoxizität bei BRCA2-defizienten Zellen bekräftigt. Darüber hinaus wurde durch Hochdurchsatzanalysen bestätigt, dass eine hitzevermittelte, erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem Knockdown zahlreicher HR-spezifischer Komponenten ausbleibt.
Durch Hochdurchsatzanalysen sowie durch anschließende Validierungsexperimente wurden Proteine identifiziert, die sich als relevant für weitere präklinische und klinische Untersuchungen herausgestellt haben. Die Proteine BRCA1, PARP1 und CHEK1 stellen dabei potentielle molekulare Marker für ein Tumoransprechen auf die Kombinationstherapie von Tr und Hyperthermie dar. Deren Inhibition erwi