Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19 Ludwig-Maximilians-Universität München

RNA (rRNA), die eine wichtige, primär funktionale Rolle in der Zellphysiologie einnimmt. Die Gene dieser rRNA lassen sich in hochkonservierte und hochpolymorphe Bereiche unterscheiden. Während in den konservierten Regionen kaum Mutationen zu finden sind, werden in den polymorphen Abschnitten je nach Grad der Verwandtschaft große Sequenzunterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten beobachtet. Individuen einer Art zeigen diese Unterschiede nicht. Somit können diese artspezifischen Abweichungen dazu genutzt werden, biologische Materialien unbekannter Herkunft einer bestimmten Tierart zuzuordnen. Mit der Amplifikation und anschließenden Sequenzierung eines Bereiches innerhalb des mitochondrialen 12S-Gens sowie der Auswertung bereits publizierter Sequenzen gelingt die Identifizierung einer Spezies anhand von 20 – 25 Basen. Dazu kann neben der etablierten Methode der Sequenzierung nach Sanger auch die Technik der Pyrosequenzierung genutzt werden.
Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit der Identifizierung verschiedener Arten durch die Analyse kurzer Fragmente ihrer 12S-Gen-Sequenz. Dazu reicht die Amplifikation des gewünschten Fragmentes mit Hilfe eines Primerpaares. Für degradierte DNA wurde ein alternativer Rückprimer getestet, der die Amplifikation eines kürzeren Sequenzabschnittes ermöglicht. Es wurden insgesamt 91 Proben verschiedener Tiere analysiert, die sich aus 8 Säugetier-Arten, 2 Fisch-Arten und 3 Vogel-Arten zusammen setzten.
Zudem kann und wird die Methode bereits bei Fragestellungen in der forensischen Routine angewendet.

In der vorliegenden Arbeit wurden therapeutische und immunmodulatorische
Effekte einer TNF-Blockade bei Patienten mit aktiver Spondylitis ankylosans untersucht. Hierzu wurde an 10 Patienten während einer 60wöchigen Infliximabtherapie eine Evaluation von Therapiewirksamkeit und -sicherheit, sowie eine durchflusszytometrische Analyse der HLA-Oberflächenexpression auf Lymphozyten vorgenommen.
Von 8 Patienten wurde die Therapie ohne ernste Nebenwirkungen gut vertragen und führte zur raschen und dauerhaften Verbesserung der klinischen, laborchemischen und radiologischen Verlaufsparameter. Ein Patient entwickelte nach initialer Wirksamkeit ein sekundäres Therapieversagen, bei einem weiteren Patienten wurde die Therapie unter dem Verdacht eines medikamentös induzierten Lupus-Syndroms abgebrochen.
Gegen Mitte des Behandlungszeitraumes konnte ein am deutlichsten auf den B-Lymphozyten ausgeprägter Anstieg der HLA-B27- und MHC-Klasse-I-Expression beobachtet werden. Die Expressionszunahme ist möglicherweise Ausdruck immunmodulatorischer Effekte, die mit der langfristigen Therapiewirksamkeit assoziiert sind.

Für die Zunahme der Oberflächenexpression kommen folgende Mechanismen in Frage:

1. eine vermehrte intravasale Kompartimentierung primär hoch exprimierender Zellen oder
2. eine durch die TNF-Suppression induzierte Hochregulation einer zuvor niedrigeren HLA-B27-Oberflächenexpression.

Angesichts unserer Ergebnisse und der aktuell in der Literatur verfügbaren Daten halten wir letzteren Mechanismus für wahrscheinlicher. Innerhalb dieses Erklärungsmodells ist die bei Therapiebeginn niedrigere HLA-B27-Expression bedingt durch die Expression einer verminderten Anzahl von HLA-B27-Molekülen oder aberranter β2m-freier Varianten, die durch die von uns verwendeten konformationsabhängigen Antikörpern nicht detektierbar sind. Unter Hemmung des TNF-Einflusses kommt es schließlich zur schrittweisen Wiederherstellung der physiologischen Prozessierung trimolekularer HLA-B27-Oberflächenantigene mit konsekutiv vermehrter AK-Bindung. Eine verminderte oder aberrante HLA-B27-Expression ist möglicherweise mit immunmodulatorischen Effekten im Sinne einer erhöhten Zelldepletion assoziiert. Durch die Reexpression trimolekularer HLA-B27-Moleküle wird die Interaktion zwischen immunkompetenten Zellen und HLA-B27-positiven Zellen beeinflusst, wodurch das Zellüberleben begünstigt wird. Dieser Erklärungsansatz ist vereinbar mit dem gegenwärtig favorisierten pathogenetischen Modell der fehlerhaften HLA-B27-Prozessierung und der derzeit diskutierten Beteiligung von TNF bei der Manifestation der AS.

Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitätsfaktoren, die es ihnen ermöglichen, an die Zellen des Wirtes zu adhärieren, diese zu invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren.
Dazu gehören die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ III Sekretionsweg über die Bakterienmembran in die Wirtszelle transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE unterstützt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation, stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP übertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellulär dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE in vitro verfolgt werden.
Zusammenfassend ist die Darstellung der Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete Grünfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von BFP, ferner überlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in einem grossen Bereich, sodass es unabhängig von einem möglichen FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grünfluoreszenz aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann.
Im zweiten Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro Stimulation produziert werden, mit einem Verhältnis deutlich zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen für ein Modell der Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE. Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilität von GFP die fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.

Pathogene Yersinien injizieren während einer Infektion über ihr TypIII-Sekretionssystem
bakterielle Moduline, sogenannte Yops, in Immunzellen, um das Immunsystem zu stören. Zu
Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die injizierten Yersinia enterocolitica-Moduline YopE
und YopT das Aktinzytoskelett angreifen. Mit dem Ziel der näheren Charakterisierung der
zugrunde liegenden Mechanismen wurde insbesondere der Effekt von Y. enterocolitica-YopE
auf aktinregulierende Signaltransduktionswege in menschlichen Endothelzellen (HUVEC)
untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Yersinia-Stamm hergestellt, welcher YopE als
einzigen Effektor transloziert.
Mit diesem Stamm infizierte ruhende HUVEC zeigten eine Veränderung des
Aktinzytoskeletts ähnlich wie nach Mikroinjektion von dominant negativem N17Rac, was auf
eine Inaktivierung von Rac hindeutete. Zur weiteren Untersuchung wurden in infizierten
Endothelzellen durch extrazelluläre Stimuli einzelne Rho-GTPasen aktiviert und die dabei
ausgebildeten Aktinstrukturen beobachtet. Dabei ergab sich keine Beeinträchtigung der
Neubildung CDC42- und Rho-vermittelter Aktinstrukturen (Filopodien und Stressfasern)
durch YopE, jedoch eine spezifische Hemmung Rac-induzierter Lamellipodien.
Frühere Untersuchungen hatten demonstriert, dass es sich bei YopE um ein sogenanntes GAP
(„GTPase activating protein“) handelt, welches in vitro die Proteine Rho, Rac und CDC42
hemmt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass in Endothelzellen
transloziertes YopE höchst selektiv auf die Ras-ähnliche GTPase Rac wirkt, jedoch keinen
Effekt auf CDC42 oder Rho ausübt. Diese Ergebnisse zeigen, dass YopE von Yersinia Rho-
GTPase-abhängige Signaltransduktionswege mit einer bemerkenswerten Spezifität in
primären Zielzellen beeinflussen kann. Überdies wurde die genannte Spezifität auch in
primären Makrophagen nachgewiesen.
Weiterhin zeigte sich im HUVEC-Infektionsversuch, dass die Hemmung der typischerweise
Rho-vermittelten Aktin-Stressfasern YopT-abhängig ist. Morphologische Veränderungen von
Aktinstrukturen, wie sie typischerweise bei der Unterbrechung von CDC42- oder Racvermittelten
Signalen vorkommen, wurden nicht beobachtet. In Zusammenhang damit konnte gezeigt werden, dass genannter Effekt auf eine chemische Modifikation und folgliche
Inaktivierung von RhoA zurückzuführen ist (Zumbihl et al., 1999).
Damit unterscheiden sich YopT und YopE in ihrem Wirkmechanismus und spezifischen
Zielmolekül, greifen andererseits jedoch beide direkt an Rho-GTPasen an. Sie könnten
deshalb synergistisch bei der Pathogenität von Y. enterocolitica wirken. Darüber hinaus
könnten YopE und YopT aufgrund ihrer Spezifität zukünftig als wertvolle Hilfsmittel zur
Untersuchung zellulärer Regulationsvorgänge dienen