Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/19 Ludwig-Maximilians-Universität München

Mitochondrial verursachte Erkrankungen beim Menschen wurden erstmals 1959 entdeckt und 1962 von Rolf Luft beschrieben. Diese Erkrankungen sind nicht so selten, wie bisher angenommen: ihre geschätzte Prävalenz liegt bei 10-15 Fällen pro 100 000 Personen. Der Verdacht einer mitochondrialen Dysfunktion stellt sich immer dann, wenn es zu einer unerklärbaren Zusammensetzung von Symptomen bei scheinbar nicht verwandten Organen kommt. Es sind hauptsächlich das stark von der Atmungskette abhängige Muskel- und Nervengewebe betroffen. Ursächlich können Fehler in der Atmungskettenfunktion sein. Komplex - I - und IV -Mangel stellen dabei die zwei häufigsten Atmungsketten-Defekte dar. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, diese beiden Enzyme der Atmungskette NADH-CoQ-Reduktase (Komplex I) und Cytochrom-C-Oxidase (Komplex IV) in verschiedenen menschlichen Geweben (Skelettmuskulatur, Fibroblasten und Chorionzotten) zu charakterisieren. Die zu untersuchenden Variablen waren dabei die Nachweisbarkeit, die Proteinkonzentrationsabhängigkeit, die Aktivität, die Haltbarkeit und die Kinetik der Enzymkomplexe. In Bezug auf die pränatale Diagnostik sollte die Verwendbarkeit von Chorionzotten geprüft werden. Aktivitätsmessungen von Patienten wurden dargestellt und diskutiert. Die Skelettmuskulatur wies die am höchsten messbaren Aktivitäten bei beiden Komplexen auf. Bei den enzymkinetischen Studien zeigten alle untersuchten Gewebe für beide Komplexe lineare Verläufe der Lineweaver-Burk-Diagramme. Die sich aus den Diagrammen ableitende Maximal-Geschwindigkeit war für den Skelettmuskel in beiden Enzymen am höchsten. Das Muskelgewebe wies jedoch gegenüber den Fibroblasten und Chorionzotten eine geringere Affinität zum Substrat auf. Im Stabilitätstest wurde deutlich, dass sowohl die NADH-CoQ-Reduktase wie auch die Cytochrom-C-Oxidase bei -20°C extrem lagerungsinstabil waren. Es konnte bei drei Patienten, die eine typische Klinik für einen Defekt in der Atmungskette aufwiesen, eine biochemische Ursache gefunden werden. Bei zwei Patienten wurde eine reduzierte Aktivität im Komplex I gemessen. Sie präsentierten eine milde ausgeprägte myopathische Form. Ein Säugling zeigte einen kompletten Verlust der Komplex-IV-Atkivität. Dieser litt an Krampfanfällen, muskulärer Hypotonie und schwerer Azidose litt. Er verstarb an respiratorischer Insuffizienz am 10. Lebenstag

Die humanpathogenen Bakterien Yersinia enterocolitica und Yersinia pseudotuberculosis sind die Verursacher von Darminfekten wie Enteritis und Enterokolitis. Das äußere Membranprotein YadA stellt bei Y. enterocolitica einen essentiellen Pathogenitätsfaktor dar. Seine virulenzassoziierten Eigenschaften sind die Fähigkeit zur Autoagglutination, die Bindung an Moleküle der extrazellulären Matrix, an Epithelzellen und Granulozyten, und die Vermittlung von Serumresistenz. Welchen Teil die verschiedenen Domänen des Proteins zur Struktur und Funktion beitragen, war bisher kaum bekannt. Auch der Versuch, dem Adhäsin durch einen Domänenaustausch völlig neue Bindungs- oder Reaktionseigenschaften zu vermitteln, war bislang nicht unternommen worden.
Darum wurden In-Frame-Deletionsmutanten, mit FLAG-Epitopen oder FaktorXa-Proteaseschnittstellen versehene YadA-Mutanten erstellt und FimH-YadA-Hybridproteine konstruiert.
Die verschiedenen YadA-Mutanten wurden strukturell auf ihre Außenmembranlokation, Oberflächenexposition und Oligomerisierung untersucht, funktionell auf ihre Adhäsionseigenschaften und Serumresistenz.
Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden:
Kopf- und Stieldomäne bilden zusammen mit der interponierten, stark konservierten Neck-Region die translozierte, oberflächenexponierte Passenger-Domäne.
Die C-terminale Membranankerregion (as 353-422) ist ausreichend für Insertion in die Außenmembran und Bildung eines trimeren YadA.
Die Linker-Region vermittelt die Translokation der Passenger-Domäne durch die Außenmembran.
Somit zeigte sich, dass YadA alle Kriterien für einen Autotransporter erfüllt.
Der Versuch, ein Hybridadhäsin mit Mannosebindungsfähigkeit durch Austausch der Kopfdomäne mit der Lektin-Domäne von FimH zu erzeugen, schlug fehl. Dies zeigt, wie empfindlich Passenger-Domäne und Membrananker von YadA aufeinander abgestimmt sind.
Die funktionelle Untersuchung der Mutanten ergab, dass die hochkonservierte Neck-Domäne zusammen mit der Kopfregion ein Bindungsmodul für Kollagen und Epithelzellen darstellt.
Im Serumresistenztest erwiesen sich Kopf-, Neck- und auch Teile der Stiel-Region für ein Überleben entbehrlich. Es zeigte sich, dass keine Domäne für die Serumresistenz von YadA entscheidend ist.

Ermittlung des Stellenwertes der CT, der diagnostischen Laparoskopie und Laparotomie im Falle eines unklaren akuten Abdomens. Aus den Ergebnissen Ableitung von Empfehlungen für die klinische Praxis. Außerdem Ursachenverteilung für das unklare akute Abdomen.

Hyaliner Knorpel ist ein Gewebe mit geringer Selbstheilungstendenz. Neben der Orthopädie besteht auch in der Kopf-Hals-Chirurgie großer Bedarf an Knorpelgewebe zum Einsatz im Rahmen rekonstruktiver und plastischer Eingriffe. Die gängigen Methoden des Knorpelersatzes umfassen autologe und allogene Knorpeltransplantationen sowie die Verwendung alloplastischer Materialien. Diese Verfahren sind mit einigen Nachteilen, wie Infektionsübertragung und immunologischen Abstoßungsreaktionen, behaftet. Die Züchtung von autologem Knorpelgewebe aus isolierten Knorpelzellen eines Patienten mit den Methoden des Tissue Engineering stellt eine vielversprechende Alternative zu den genannten Verfahren dar.
Zur Optimierung der Methoden der Knorpelzüchtung wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Wachstumsfaktoren IGF-1 und TGFβ-2 auf tissue-engineerten Knorpel nach Kultur in vitro und anschließend in vivo untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss zweier vollresorbierbarer Trägermaterialien – Ethisorb-Vliese mit Standard oder reduziertem Gehalt an PDS – auf das Verhalten der gezüchteten Gewebe in vivo überprüft.
Nach enzymatischer Gewinnung von Einzelzellen aus humanem Septumknorpel wurden diese in Monolayer-Kultur amplifiziert und anschließend auf Ethisorb-Vliese aufgebracht. Unter diesen dreidimensionalen Kulturbedingungen wurden die Wachstumsfaktoren in Kombination als Zusatz zum Kulturmedium verwendet. Die Zell-Copolymer-Konstrukte wurden dann für 4 und 12 Wochen subkutan in homozygote thymusaplastische Nacktmäuse implantiert, um ihr Verhalten in vivo zu untersuchen.
Nach der dreidimensionalen Kultur in vitro und nach 4 bzw. 12 Wochen in vivo wurden die Konstrukte nach ihrem Resorptionsverhalten beurteilt, gewogen, histologisch und biochemisch untersucht. Dabei wurden die Zellzahl sowie der Glykosaminoglykan- und Hydroxyprolingehalt der Präparate bestimmt.
Die Wachstumsfaktoren hatten in der eingesetzten Konzentration und Kombination sowie unter den verwendete Kulturbedingungen keinen eindeutig positiven Einfluss auf die gezüchteten Gewebe. Mit Ausnahme des Nassgewichts nach der Kultur in vitro, war keiner der erhobenen Parameter in der Versuchsgruppe signifikant von der Kontrollgruppe verschieden.
64
Trägermaterialien mit reduziertem Gehalt an PDS führten nach Implantation in das Versuchstier signifikant häufiger zu Resorptionen der Zell-Copolymer-Konstrukte und sind damit zur Züchtung von Knorpelgewebe mit den verwendeten Methoden wenig geeignet. Ethisorb-Vliese mit Standard PDS-Gehalt wurden dagegen als geeignete Zellträger zur Züchtung von Knorpelgewebe bestätigt.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass zur Optimierung der Kulturmethoden im Tissue Engineering von Knorpel weitere Untersuchungen über den Effekt von Wachstumsfaktoren nötig sind, im Besonderen bei der Verwendung von humanen Septumknorpelzellen.

It is unclear how angiogenesis and restoration of perfusion determine graft function after free parathyroid autotransplantation.We provide a new animal model allowing simultaneous and repetitive in vivo assessment of angiogenesis and endocrine function of parathyroid transplants. Methods:Fresh human parathyroid tissue from patients with secondary hyperparathyroidism was grafted into dorsal skinfold chamber preparations of athymic nude mi(CD1-nu BR; n=8). Equivalent pieces of the same human donor specimens were heat-inactivated and served as control grafts (n=7).Results:In all animals receiving parathyroid transplants human parathyroid hormone levels were detectable by species-specific ELISA analysis of plasma samples on day 5 after transplantationand increased by 2.5 fold over the observation (19 days) in contrst to controls (day 19: 82.5+/-29.3 vs. 0.0+/-0.0 pg/ml; p0.05).Plasma Calcium-levels revealed no differences between the groups. On day 5 after transplantation intravital fluorescence microscopy revealed first murine angiogenic microvessels sprouting alongg non-perfused human donor vessels and one week later functional microvasculature was established in all parathyroid transplants. Histological analysis of HE- and vWF- contrast, control grafts were either necrotic and partly resorbed exhibiting no angiogenic activity or revealed well vascularized fat cells indicating fatty degeneration. Aditionally, species-specific Western blot analysis revealed vascular endothelial growth factor expression of parathyroid transplants as functional parameter of angiogenesis determining transplant function in vivo. Conclusion: This model may serve to understand mechanisms associated with specific parathyroid transplant angiogenesis and its significance for transplant function in order to optimize clinical success of autotransplantation in therapy-resistant patients.