Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19 Ludwig-Maximilians-Universität München

In der vorgelegten Arbeit wurden Histonmethyltransferasen untersucht. Die beiden SET-Proteine, Enhancer of Zeste (E(z)) und PRset7 methylieren jeweils spezifische Lysine in den N-Termini der Histonmoleküle H3 bzw. H4 und wurden zu Beginn in E. coli exprimiert.

In Histonmethyltransferase-(HMTase)-Versuchen konnte mit E(z) keine Aktivität erzielt werden. Mit einer eingeführten Mutation des aktiven Zentrums („E(z)mut“) und mit E(z) konnte nach der Inkubation mit Drosophila-Kernextrakten an beiden Proteinen die Histondeacetylase Rpd3 nachgewiesen werden, die enzymatisch aktiv war. Unsere Arbeitsgruppe konnte die HMTase-Aktivität eines E(z)-Komplexes bestätigen, die von einer (nicht-mutierten) SET-Domäne abhängt (Czermin et al., 2002).

Die Untersuchungen zur Histonmethyltransferase PRset7 begannen mit Aktivitäts- und Spezifitätsversuchen an verschiedenen Substraten. Die nukleosomale Spezifität von PRset7 bestätigte sich gemäß den Ergebnissen von Fang et al. und Nishioka et al. (Fang et al., 2002; Nishioka et al., 2002b). PRset7 unterschied klar zwischen rekombinanten Nukleosomen (Histone rekombinant in E.coli exprimiert) und nativen Nukleosomen (Histone aus Drosophila-Embryos gereinigt), wobei letztere deutlich vermindert methyliert wurden. An rekombinanten, mit PRset7 methylierten Nukleosomen, konnte mit einem H4 K20-methyl-Antikörper eine H4 K20-Methylierung detektiert werden. Mit Hilfe verschiedener, rekombinanter Nukleosomen, deren H4-Moleküle N-terminal unterschiedlich lang waren, konnte die Substraterkennung bzw. -bindung von PRset7 auf maximal 9 Aminosäuren vor Lysin 20 eingegrenzt werden. Durch die Reinigung des Proteins wurde deutlich, dass kürzere Degradationsprodukte von PRset7 den wesentlichen Anteil der detektierten HMTase-Aktivität ausgemacht hatten, ohne die hohe nukleosomale Substratspezifität zu verlieren. Für die Substratherstellung weiterer in vitro-Versuche zur Beziehung zwischen H4-Acetylierung (K12 bzw. K16) und H4-Methylierung (K20) wurde die Histonacetyltransferase MOF rekombinant hergestellt, gereinigt und die enzymatische Aktivität bestätigt. Es ergab sich keine eindeutige positive oder negative gegenseitige Beeinflussung der beiden Modifikationen. Abschließend wurden die verwendeten Antikörper bezüglich ihrer Spezifität untersucht, welche gegeben war.

Der Bedarf nach schnellen, schmerzarmen und erfolgreichen Wurzelkanalbehandlungen steigt. Einer der wichtigsten Parameter, der über den Erfolg oder Misserfolg einer Wurzelkanalbehandlung entscheidet, ist die vollständige Entfernung der Bakterien und Gewebereste aus dem Wurzelkanal.

In der vorliegenden Studie sollte an Hand einer tierexperimentellen in vivo Untersuchung gezeigt werden, in wie weit die Abgabe eines Stromimpulses zu einer Veränderung des Weichgewebes im Kanal und am Periapex führt. Nach vorangehender endometrischer Längenbestimmung führt das Endox-Gerät durch Applikation von hochfrequentem Wechselstrom im Wurzelkanal zur Gewebskoagulation. Die Oberkiefermolaren des ersten Quadranten von insgesamt 21 weiblichen Wistar-Ratten wurden behandelt und okklusal mit Harvard-Zement verschlossen. Drei Tiere wurden als Kontrollgruppe in Narkose gelegt, ohne die Molaren zu behandeln. Die Ratten wurden nach 1, 90 und 180 Tagen geopfert und das zu untersuchende Gewebe entnommen. Es wurden histologische Schnittbilder angefertigt und mit einem Lichtmikroskop ausgewertet.

Die Gesundheit der Tiere war über den Zeitraum der Untersuchung gut. Es konnte keine Einschränkung des Allgemeinempfindens auf die Behandlung mit Endox® zurückgeführt werden. Genauso hatte die Narkose keine nennenswerte Auswirkung auf den Versuch. Die endometrische Längenkontrolle war aufgrund der zu kurzen Wurzeln nicht möglich. Der okklusale Verschluss mit Harvard-Zement hielt nicht über den gesamten Zeitraum der Untersuchung. Die intraorale Untersuchung ergab intakte Füllungen in der 1-Tages-Versuchsgruppe. Die restlichen Versuchsgruppen wiesen Füllungsverlust auf, welcher mit der Kaufunktion von Nagetieren in direkter Verbindung steht.

In der 1-Tages-Versuchsgruppe zeigten sich geringgradige thermische Schäden im unmittelbar dem Zement angrenzenden Bereich. Das Wurzelkanallumen war vollständig sauber. In wenigen Kanälen fanden sich einzelne verkochte Gewebereste, die auf die Wirksamkeit der Gewebskoagulation hindeuten. Die 90- und 180-Tages Versuchsgruppe wiesen chronische Entzündungen im Wurzelkanalbereich und dem Desmodont auf. Diese wurden durch den Verlust der okklusalen Füllungen ermöglicht. In keiner der drei Versuchsgruppen konnten Unterschiede zwischen ein- und drei- bzw. fünfmaliger Impulsabgabe festgestellt werden. Dies muss jedoch auf die Kürze des Wurzelkanals zurückgeführt werden, in dem schon ein Impuls ausreicht, um das Gewebe vollständig zu verdampfen.

Die statistische Auswertung ergab keinen Zusammenhang zwischen dem Füllungsgrad und der Entzündung, obwohl das klinische Ergebnis eindeutig ist. Der Grund liegt in der geringen Stichprobenzahl. Die Ergebnisse der 1-Tages-Versuchsgruppe werden ausschließlich auf die Behandlung mit Endox® zurückgeführt. In dieser Gruppe konnte die Wirksamkeit der Gewebskoagulation bis in die Tiefen der Dentintubuli gezeigt werden. Die geringgradige thermische Alteration im Desmodont war zu erwarten, da die Dicke des Dentinmantels nicht derjenigen des menschlichen Zahnes entspricht.

Insgesamt kann man die Ergebnisse dieser Studie als erfolgsversprechend einstufen. Es konnte gezeigt werden, dass das Endox-Endodontiesystem in vivo bei richtiger Handhabung in der Lage ist, das Wurzelkanallumen vollständig von Geweberesten zu befreien. Die Reaktionen im Desmodont und am Periapex entsprechen einer physiologischen Reaktion auf die Wurzelkanalaufbereitung. Die Anwendung ist einfach und zeitsparend. Das Endoxgerät ist für die schnelle Bakterienreduktion, wie sie bei der Behandlung von Pulpitiden notwendig ist, besonders geeignet. Für den Patienten resultiert daraus eine Verkürzung der Behandlungsdauer verbunden mit einer höheren Erfolgsquote von Wurzelkanalbehandlungen. Darüber hinaus kann das Ausmaß der Röntgendiagnostik auf ein Minimum beschränkt werden. Dies ist besonders interessant bei Behandlung von Kindern und Schwangeren. Durch weitere klinische Studien muss die

Bei Patienten mit malignen gastrointestinalen Tumoren kommt es auch nach erfolgter R0-Resektion des Primärtumors häufig in der Folgezeit noch zur Ausbildung von Fernmetastasen. Ursächlich hierfür sind disseminierte Tumorzellen, die sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Tumorentstehung vom Primärtumor absiedeln, anschließend jedoch in eine Art Ruhephase als „dormant cells“ fallen und erst zu einem späteren Zeitpunkt wieder in die Proliferationsphase eintreten. Hinsichtlich der Evaluation des Rezidivrisikos stellen diese disseminierten Zellen zwar einen unabhängigen Prognosefaktor dar, sind jedoch im Einzelfall mit bisher zur Verfügung stehenden Nachweismethoden nur unzureichend zu identifizieren. In dieser Arbeit haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein diagnostisches Verfahren zu entwickeln, das es uns einerseits erlaubt, disseminierte Tumorzellen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu charakterisieren und quantifizieren, andererseits dem Patienten eine permanente Verlaufskontrolle durch einen einfachen Zugang zu ermöglichen.
Hierfür entwickelten wir eine quantitative Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), die hinsichtlich der Zielstruktur auf die außerordentlich spezifische Familie der Melanom-Antigen-Gene (MAGE)-A ausgerichtet war. Die Expression dieser Antigene konnte bisher in vielen verschiedenen Tumortypen nachgewiesen werden, nicht jedoch in nicht-tumorösen, adulten Geweben mit Ausnahme des Hodens. Eine hohe Sensitivität der Methode war durch die Identifikation einer Consensus-Sequenz der MAGE-A-Gene gewährleistet, wodurch wir in der Lage waren, unsere Primer so zu konstruieren, dass in einem Ansatz die MAGE-Subtypen A1-A6 gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Zum einen führten wir damit Zellverdünnungs-Experimente mit der Kolonkarzinom-Zelllinie HT 29 durch, bei denen jeweils 10 ml zentralvenöses Vollblut mit einer unterschiedlichen Anzahl HT 29-Zellen versetzt wurden. Ebenfalls wurden zur Kontrolle 14 Vollblutproben von Patienten ohne Tumorerkrankung aufgearbeitet. Zum anderen untersuchten wir 22 zentralvenöse prä- und postoperative Vollblutproben von Patienten mit operablen gastrointestinalen Tumoren und 19 intraoperativ gewonnene Peritoneallavagen auf das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen.
Die Zellverdünnungs-Experimente erbrachten das Ergebnis, dass mit dem verwendeten Analyseverfahren das Vorhandensein von fünf einzelnen Tumorzellen in zehn Millilitern zentralvenösen Vollblutes nachgewiesen werden kann. Dies entspricht einer Empfindlichkeit des Nachweises von einer malignen Zelle in 107 bis 108 mononuklären Zellen. Alle 14 untersuchten Negativkontrollen wurden korrekt als MAGE-A-negativ identifiziert. Von den 22 Vollblutproben der Tumorpatienten konnte präoperativ bei 10 (= 45,5%), postoperativ bei 13 (= 59,1%) eine Disseminierung nachgewiesen werden. Fünf der 19 analysierten Peritoneallavagen erbrachten ein MAGE-A-positives Ergebnis. Dabei zeigte sich keinerlei Abhängigkeit der Disseminierung von der Tumorausdehnung (pT), der Lymphknotenbeteiligung (pN), Fernmetastasen (M), Grading (G), Tumortyp, Alter oder Geschlecht der Patienten.
Ob und in welcher Art und Weise die Expression von MAGE-Genen möglicherweise Zellen überhaupt erst dazu befähigt, sich vom Primärtumor abzusiedeln und welchen Einfluss die Operation selbst am Auftreten einer Disseminierung maligner Zellen hat, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausreichend untersucht und sollte Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein.
Hierfür haben wir ein hochsensitives und –spezifisches Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen entwickelt, auf dessen Grundlage es gelingen könnte, geeignete Patienten spezifischen adjuvanten Immuntherapiekonzepten mit MAGE als Zielstruktur zuzuführen und so das späte Auftreten von Metastasen zu verhindern.

Zusammenfassend lassen sich vier Hypothesen beschreiben: Unspezifische chronische Entzündungsreaktion bei den Tourette-Patienten, Einfluss des zellulären Immunsystems auf das Tourette-Syndrom, Autoimmunhypothese, Ähnlichkeiten mit dem Krankheitsbild der Chorea-Akanthozytose